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封閉

在轉膜之后，也就是抗體孵育之前，需要對膜進行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。常用的封閉液有BSA，脫脂奶粉，血清等，一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用；不能用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術，一種抗體一個脾氣。

對WB結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。 無論你如何提高自己的轉膜技術，和低效之間往往只有數倍的差異， 而抗體的效價可以差數千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價 不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結合的蛋白，包括單克隆抗體和多克隆抗體；二抗：第二抗體能和一抗結合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測抗體的存在，放大一抗的信號。一般二抗都會偶聯可以檢測的標記（如熒光、放射性、化學發光或顯色基團），用來檢測一抗；如果一抗本身偶聯有這些標記，則不需要二抗，就是所謂的直接WB。

那么如何正確的來選擇二抗呢？*根據一抗的種屬來源選擇二抗；第二根據一抗的類型選擇二抗，根據單體數量和重鏈分類，將抗體分為IgA，IgD，IgE，IgG，IgM五類。其中又可分為幾個亞型：IgA1-2，IgG1a，2a，2b，3，IgM1-2。

顯色

酶促反應可以搭配不同的底物從而實現不同的顯色方法：化學發光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發研制靈敏度更高的發光底物，化學發光法的靈敏度已經達到pg別，甚至還有 Femto級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。zui為大家熟悉當數辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見問題分析：

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分：延長封閉時間，更換合適的封閉劑；一抗濃度過高：增加一抗稀釋倍數；抗體孵育溫度過高：4℃孵育；二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應：設置二抗對照（不加一抗），降低二抗濃度。

洗膜不充分：增加洗膜次數

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配：訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或底物與酶系統之間相匹配的抗體及底物，可通過設置內參驗證二級系統的有效性； 更換更好的抗體；一抗，二抗濃度低：增加抗體濃度，延長孵育時間封閉劑與一抗有交叉反應：封閉時使用溫和的去污劑，更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少，設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加樣本上樣量；轉膜不充分還洗膜過度：使用麗春紅S檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透，正確的轉膜操作，勿過度洗膜；曝光時間過短：延長曝光時間，更換更靈敏的發光液

3.背景有白色/黑色斑

轉膜時有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡，抗體孵育時保持搖動；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

ECV-304細胞 ECV-304細胞運輸：凍存的細胞干冰運輸，復蘇的細胞冰袋運輸。冬季我們會選擇全血清包被細胞運輸，運輸途中細胞處于休眠狀態，避免天氣過冷導致的細胞死亡。

ECV-304細胞 ECV-304細胞在運輸、轉移過程中，請勿打開自封袋；拿放細胞時請持瓶體，切勿在非無菌環境中碰觸、擰動瓶口封口膜位置

進入生物安全柜前，打開自封袋拿出培養瓶，噴上酒精放進操作臺(不建議使用酒精棉球擦拭)，撕開封口膜后，用酒精燈外焰對瓶口燒灼一圈(3秒左右)

細胞凍存如下：

1．細胞：選對數生長期細胞，收集細胞24小時前換液一次。

2．計數：按常規方法把細胞制成細胞懸液，計數，令細胞密度達5×106/ml，離心去上清，吸入離心管中。

3．凍存液：先用培養液9分＋DMSO 1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液，按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。

4．分裝：分裝入無菌安剖中，每安剖加1.5毫升細胞懸液。

5．封口：用塑料安剖時擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安剖口后，仔細檢查，定要封嚴，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見，把安剖縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存日期，以便日后查找。

豎立培養瓶，擰開瓶蓋(如是貼壁細胞，請用真空泵或吸管移除原配培養基，切勿讓瓶口處的液體回流進瓶內)

更換為含10%-20%血清的*培養基，嚴格按照無菌操作要求繼續培養。