在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的變化，而此時Propidium Iodide（PI）不能通過細(xì)胞膜。

細(xì)胞壞死時，雖然也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，但此時細(xì)胞膜的通透性明顯增加，PI等核酸染料進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。所以Annexin V-FITC(綠色熒光)常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞。

技術(shù)原理及步驟

1. 離心收集細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000 rpm，離心時間5 min，棄培養(yǎng)基。

2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106 cells/mL。

4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕輕混勻后于2~8°C避光條件下孵育15min。

5. 加入10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min。

6. 在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。

應(yīng)用實例

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞的早期凋亡及區(qū)分凋亡與壞死細(xì)胞

服務(wù)周期

我公司在正式接受實驗委托2個星期左右完成實驗并提供實驗報告。

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

需提供細(xì)胞類型，處理條件。

慧穎生物專業(yè)血清10年，我們不生產(chǎn)血清，我們只是高品質(zhì)動物血清的搬運(yùn)工

血清是一種成分復(fù)雜的混合物，不同批次血清對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用不同。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個方面：

1、細(xì)胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時，會出現(xiàn)對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

2、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會變差；比如：細(xì)胞瓶里會出現(xiàn)一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細(xì)胞向四周擴(kuò)展生長。

3、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子，會使細(xì)胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細(xì)胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動細(xì)胞瓶會看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞萎縮的情況越來越嚴(yán)重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細(xì)胞長的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進(jìn)去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費(fèi)，浪費(fèi)人力、物力，尤其是時間上的浪費(fèi)，從培養(yǎng)細(xì)胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費(fèi)掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險之一。

5、細(xì)胞生長的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價低。這種情況比較常見，細(xì)胞是病毒的載體，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)不好，病毒就無法進(jìn)行正常的復(fù)制。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。

看來一款血清直接關(guān)系細(xì)胞的生死存亡，不用擔(dān)心，慧穎提供無支原體，低內(nèi)毒素和低血紅素的，無反復(fù)凍融的高品質(zhì)Sv30087.02血清

產(chǎn)品名稱    貨號    來源    規(guī)格    市場價格

產(chǎn)品名稱    貨號    來源    規(guī)格    市場價格

胎牛血清FBS Sv30087.01  SOUTH AMERICA   100ML   800

胎牛血清FBS Sv30087.02  SOUTH AMERICA   500ML   1800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

特級胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

特級胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS  SH30068.03  USA 500ML   6000

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活，Charcoal Stripped FBS    SH30068.03HI    USA 500ML   6000

新生牛血清New born calf serum   SH30406.01  New Zealand 500ML   1300

馬血清Horse Serum   SH30074.03  USA 500ML   980