Invitrogen脂質體2000的操作流程及注意事項

Invitrogen脂質體2000的操作流程及注意事項

*，Invitrogen脂質體2000是廣大老師所熟知的轉染試劑，其特點：轉染步驟快速簡便

（1）DNA-陽離子脂質體試劑的復合體可以直接加入到細胞培養基中，有血清也不怕。

（2）轉染后不需要除去Lipofectamine 2000試劑，無需換培養基。

我們介紹一下 Invitrogen脂質體2000的操作流程、注意事項等。

一、操作流程   
事實上Lipofectamine系列產品操作流程都是又快又簡單：稀釋DNA以及Lipofectamine 2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養細胞中孵育24－96小時檢測結果。下面是Invitrogen提供的詳細流程和注意事項。
1、轉染前一天，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        含血清，不含抗生素的正常生長的培養基中。
2、對于每孔細胞，使用50μl無血清培養基（如OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋0.8μg-1.0μg DNA。3、對于每孔細胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培養基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細胞也可以使用D-MEM培養。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液，必須在5分鐘內同稀釋的DNA混合。
4、混合稀釋的DNA（第2步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。 注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉染。復合物可以在室溫保持6小時穩定。
5、直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。注意：如果在無血清條件下轉染，使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基，替換為0.5ml無血清培養基。
6、在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復合物或更換培養基或者在4-5小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。
7、在細胞中加入復合物24-72小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。
8、對于96孔板培養，不再需要提前一天進行細胞鋪板，而可以直接在平板中制備復合物，然后將細胞懸浮液加入到復合物就可以了，這樣進一步減少了轉染時間。這種改進步驟已經過293-H，293-F，COS-7L和CHO細胞的試驗，同傳統方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達細胞系的轉染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉染，比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達。

二、適用細胞株范圍
不同的轉染試劑所適用的細胞株范圍各不相同。一個實驗室常常會用到不止一種細胞株，甚至是比較特殊的細胞株。一個轉染試劑所適用的細胞株越多，當然越受用戶的歡迎。根據Invotrogen的資料，Lipofectamine 2000已經證實可用于高達517種細胞株，覆蓋了相當廣的范圍。要看看Lipofectamine 2000是否適用于你現有的細胞株，可以訪問以下Invitrogen

三、適用的核酸類型和DNA大小    
有的轉染試劑是為siRNA轉染而設計的，有的則是為DNA轉染設計。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 熒光標記的Oligo, RNA等在內的核酸轉染，這使得Lipofectamine 2000適用范圍非常廣泛，無論是基因表達分析的DNA轉染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能勝任，不需要為不同目的購買不同試劑了。但，zui常用的DNA轉染中有一個DNA大小的問題，太大的質粒不那么好轉。

四、用量
Lipofectamine 2000用的劑量根據說明書，24孔板轉染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉染，或者大約150次6孔板轉染。

五、注意事項         
 Lipofectamine 2000要求細胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質體細胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000可用于有血清培養基的轉染，并且轉染前后不需要換培養基，使得操作方便了許多，但是要注意制備轉染復合物時要求用無血清培養基稀釋DNA和轉染試劑，因為血清會影響復合物的形成。

復合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測所用的無血清培養基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外還應該留意，如果研究的基因要求比較長的表達時間，比如細胞周期相關基因，或者時細胞表面蛋白，選擇細胞鋪板密較低的轉染試劑，不適合用 Lipofectamine 2000。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 

對于大多數陽離子脂質體試劑，應優化DNA濃度和陽離子脂質體試劑量以得到zui大的轉染效率。DNA和轉染試劑的比例，通常推薦是1:2或者1:3，優化可以從0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優化條件可以用于進行大劑量的轉染，只要根據培養板表面比例線性增加鋪板細胞的數目、陽離子脂質體試劑和DNA量就可以了。

還有轉染的時候培養基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。所以，在轉染培養基中不能使用抗生素，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣，在轉染前就不必潤洗細胞。對于穩定轉染，不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養基中細胞的健康生長，使用比含血清培養基更少的抗生素量。

陽離子脂質體應該在4度保存，要注意避免多次反復長時間開蓋，因為可能會導致脂質體氧化而影響轉染效率。當然還有要注意質粒的質量，質粒的內毒素是轉染的大敵。