加樣、溫育和洗板操作不當尤其影響ELISA測定結果

ELISA測定現通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。慧穎生物。

    加血清樣本及反應試劑：

    在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是惟一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是，加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孑L之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。慧穎生物。

    溫育：

    溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui為常用的溫育溫度有37~C和室溫，其次是43~C和2～8~C。慧穎生物。

    溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現問題的步驟。目前國內通常ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 0．5～lh，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2h。一般來說抗原抗體反應在37℃下需要1～2h才能有較*的結合，低于1h，可能會影響測定下限。因此，關于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：

    1．要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間  一般來說，加完樣本和（或）反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱后37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。慧穎生物。

    2．溫育溫度的選擇  在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1h，另一種則為43℃下45min。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間zui為*，如2—8℃下反應24h。較高的反應溫度，由于分子運動的加快，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。慧穎生物。

    3．“邊緣效應”的排除  以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種“邊緣效應”的原因可能為96孔板外周孑L與中心孔表面或熱力學特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板孔升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應”，并且可提高測定的重復性。慧穎生物。

總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或將浸透水的紗布放入一大飯盒中成一濕盒，放于溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。慧穎生物。

    洗板：

    固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成分分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0．05％山梨醇—20的中性PBS，山梨醇—20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機制是，借助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中山梨醇—20濃度高于0．2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。慧穎生物。

    在實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至*所需的次數要少于殘留量大的洗板機。在特定臨床實驗室所使用的洗板機，到底洗多少次能達到要求，可進行下面這個簡單的實驗：選擇4X8 HBsAgELISA包被板條，每2X8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結合物并完成溫育后，洗板孔時按第1排4孔洗1次、第2排4孔洗2次、第3排4孔洗3次……直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次后，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性／陰性值保持zui大不變，則可以認定該實驗室所用洗板機3次洗板即可達到要求。慧穎生物。