1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請(qǐng)按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：
 12μg/L （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
6μg/L （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 120μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
3μg/L （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 120μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
 1.5μg/L （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 120μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
 0.75μg/L （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 120μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl；在3.酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30分鐘。  
4.棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。
5.每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30分鐘。 
6.棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。
7.每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
8.取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長下測(cè)量各孔的吸光度值（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來10.計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。