Nthy-ori 3-1|Nthy-ori 3-1細胞 培養

對于貼壁細胞，若細胞漂浮：培養瓶不開封，用75%酒精擦拭后平躺置于培養箱內。次日觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以去掉，換成新鮮的培養基；如細胞還不貼壁，將細胞離心收集移到新的培養瓶中，原培養瓶加部分新鮮培養液繼續培養，中間注意觀察，我們的技術人員會一直跟蹤指導，直到問題解決。對于懸浮細胞：收到細胞后，將細胞全部離心，去掉舊的培養基，換成新鮮的培養基繼續培養。

特別注意：（如使用公共實驗室或者初次接觸，建議添加雙抗培養）

（1）貼壁細胞收到當天有少量或沒有飄忽的細胞可以當天換液，因為路途顛簸造成大量飄忽的情況時，請將細胞換液后放置培養箱孵育到第二天再做消化傳代，請優先選擇直徑6cm的培養皿進行傳代培養

（2）收到細胞后請盡快更換為含10%血清的新鮮培養基，如因特殊情況需要繼續使用原瓶，請在原瓶培養基中額外添加10%的血清，（原瓶培養基的繼續使用時間zui長不宜超過72小時）

（3）如簽收時出現培養瓶壁破裂，漏液等情況請及時做好照片記錄并SUER技術人員

細胞接收后的操作流程與注意事項：

1）貼壁細胞生長緩慢；適當提高血清濃度（zui高不能超過20%），或可根據該細胞生長特性生長密度，考慮胰酶消化后，轉移到新的培養瓶繼續培養

2）如果細胞為貼壁細胞，而收到時呈懸浮或者部分懸浮的狀態，請將懸浮的細胞即時離心，加15%血清的*培養基到新的培養皿/瓶繼續培養3天；同時原培養瓶中剩下的貼壁細胞更換為15%血清的*培養基培養3天。3天后若原瓶或者新瓶中的細胞都沒有出現增值而是繼續脫落死亡，請及時實驗室技術人員會跟進解決

3）生長不均：貼壁細胞若出現分布不均，成島狀生長，可將細胞進行消化，重懸打散細胞，加入新鮮培養基進行培養

細胞常規培養傳代流程（請嚴格遵照無菌操作）

（1）吸出原培養瓶中的培養基，PBS緩沖液潤洗細胞兩次，加2-3ml 0.25%胰酶進行消化細胞（注意把握消化時間，通常控制在1-2min）

（2）注意培養基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細胞密度達到80%以后重復1項操作或者凍存

（3）取部分細胞懸液轉移到新的培養皿/瓶中，添加適當的*培養基，把細胞懸液打勻，于培養箱中培養

（4）鏡下觀察消化情況，在HS505.T人淋巴結成纖維樣細胞生長特性邊緣縮小，貼壁松動時（不建議消化到細胞漂浮）去掉胰酶，加6-8ml*培養基，輕輕吹打細胞層，盡量把細胞層吹落，吹散。

請各位老師以隨貨說明為主

MTT點板時一定要將細胞消化成單個細胞，而且一定要混勻，用排槍，否則，MTT的SD會狂大！

2、點板布局

其實這一點很多人不懈一顧。如果你的細胞要養48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個孔的水分。因為細胞培養過程中，邊孔的水分蒸發很快，培養液及里面的藥物會出現濃縮現象，細胞的狀況就復雜了，有些人稱之為%26ldquo;邊緣效應%26rdquo;這些孔的SD也會狂大，既然如此，不如不用。

3、加MTT

如果確認你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。

4、加入MTT后的反應

時間為3-4h，此時棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉淀溶解*，盡可能將水棄除干凈，加入DMSO后在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細胞貼壁不好，此時的沉淀在棄去液體時易丟失，因此貼壁不好的細胞在點板時記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要么在棄液體時先用甩板機離心，再輕輕棄去液體。關于DMSO的量，每孔的體積有點兒差異不干擾檢測，只要能將沉淀*溶解就行了。至于DMSO的體積差異不同為什么不影響檢測值已經被數學證明了，在此我不多說，如果有人不明白我再證明給他看。當然為了養成良好的實驗習慣，DMSO的體積還是一致的好。

5、檢測MTT

還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標儀有單波長，你可以在檢測前掃描一下吸收譜，選用zui大細說波長檢測就是了，zui大波長，大概在550nm附近，必要時加一個參比波長以扣除非特異性吸收。

6、吸收值分析

在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性范圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

7、建議

如果你覺得MTT中出現的問題不好解決，那么建議你做CCK-8實驗，原理與MTT相似，但操作上簡化些，當然，費用也稍微高一些。

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