Gibco 10082-147 細胞培養小常識

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熱滅活目的是為了去除血清中補體等對熱敏感的物質，但是在胎牛血清中對補體的滅活則明顯沒有必要。Triglia和Linscott曾對商業胎牛血清中的補體成分進行測定，他們發現胎牛血清中含有的C1，C6僅達成年動物血清的1-3%，而其它補體成分僅有成年動物的5-50%，至于補體的主要成分C3在胎牛血清中則幾乎不能檢出。通過補體固定實驗，我們也在多個不同批次的胎牛血清中獲得了相似的結果。即使是在未稀釋的血清中，也未發現有明顯的溶血現象。

另外，多數實驗室在培養前將培養液進行預熱的過程，也對熱敏的補體有滅活的作用。 總之，多數細胞培養中血清的熱滅活并不是必要的。很多場合下，熱滅活并不會改善細胞的生長，卻降低了支持細胞生長的能力。即使在少數有促進的情況下，其促進的比率也是微不足道的。另外，血清的熱滅活導致的沉淀常常被認為是微生物的污染，從而給用戶和供應商都帶來不必要的麻煩。我們建議，對于那些對血清進行滅活的用戶，需要通過試驗來證實其必要性，確定滅活的適當條件；在滅活過程中，需要嚴格認真監測，并選擇一個可重復的方案進行操作。

Gibco 10082-147  細胞培養小常識

1）切記，細胞培養基的儲存條件是2-8℃。如果細胞培養基不小心被凍，您應該融化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養基可以正常使用，如果出現沉淀，只能丟棄這些培養基。

2）貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫鈉導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養箱孵育培養基10-15min，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

3） 當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

4）一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

5）總之，大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

6）血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體系統。在免疫學研究，培養ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，并沒有確鑿的證據說明這樣做是有益的。相反，對大部分細胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加，使您誤以為污染。

7）在進行傳代培養時，我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代，不進行活性檢測，您可能接種比你認為的低得多的濃度的細胞，這常常可能導致生長緩慢或培養物根本不生長。

8）在訂購的細胞到達后，應立即復蘇，如果培養基還沒有準備好，可將其放入液氮中，盡快復蘇。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內。

9）細胞復蘇往往是比較容易出問題的步驟。請在訂購細胞時就向供應商索取詳細的復蘇步驟，并仔細閱讀。有些供應商就不推薦在復蘇時離心，對此類細節，應特別留意。

10）如何避免血清中沉淀物的產生?

A) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產生沉淀物。并隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

B) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

C) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

D) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30min的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

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外泌體（Exsome）發展歷程：

外泌體的發現要追溯到1986年，Eberhard G. Trams和R.M.Johnstone在體外培養的綿羊紅細胞培養液上清中發現了一種有膜結構的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。隨后的10年，外泌體并未受到足夠的重視。直至1996年，G.Raposo發現類似于B淋巴細胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細胞來源的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗腫瘤反應。1998年，L.Zitvogel等發現樹突細胞（DC cell）也能產生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動了特異性的CTL殺傷作用，促進了T細胞依賴的抗腫瘤效應。

2007年，H.Valadi等發現，細胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質。這意味著細胞可以通過外泌體影響另外一個細胞，甚至可以把自己的基因強加給另外一個細胞。研究人員逐漸對小小的外泌體產生了極大的好奇。他們發現，腫瘤細胞的外泌體與正常細胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會促進腫瘤的生長和轉移，腫瘤周圍組織細胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細胞的能力，等等。2013年的諾貝爾生理或醫學獎頒給了三位科學家，他們分別是美國科學家James E. Rothman和Randy W. Schekman，德國科學家Thomas C. Südhof，以表彰他們發現細胞內部囊泡（外泌體等）運輸調控機制。使外泌體的研究達到全新的高度。就外泌體的研究方向而言，干細胞、免疫、microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領域。

2015年JHuan等人證實了急性髓細胞白血病（AML）的外泌體在白血病的骨髓微環境中具有抑制造血干細胞的功能。同年WANGY等人發現誘導多能干(iPS)細胞的外泌體可以在心肌細胞受到急性心肌缺血（MIR）影響時，給心肌細胞傳送保護信號。

目前，已有越來越多的學者開始關注外泌體在腫瘤發生和發展中的作用及其機制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領域發揮重要作用。2015年德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的一項研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發布，研究發現存在于癌癥外泌體（exosomes）上的glypican-1 (GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能尚處于適合手術治療階段的早期胰腺癌。研究發現，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測到的胰腺疾病跡象之時，GPC1+ crExos就檢測到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA 19-9生物標志物，GPC1+ crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。

“不同于循環腫瘤細胞(CTCs)需要大量的新鮮血液，在大約30年前保存到冷凍庫的血液樣本中也可以檢測和分離出GPC1+ crExos。可以從儲存樣本分離出的癌癥外泌體中提取出DNA、RNA和蛋白質，用于進一步的遺傳和生物分析。因此，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標記物，分離出它們還可為我們提供一個癌癥特異性信息的寶庫。”由于胰腺癌確診時常常已到晚期，只有15%的患者適合于接受手術。如果能夠早期檢測到癌癥，就可以采用胰十二指腸切除術來治療胰腺癌患者。

目前有關外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內容物分析上。其中，外泌體的粒徑表征和濃度信息是極為重要的參數。

外泌體的分離

目前，外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾三種方法。

超速離心：耗時耗力，往往需要8-30個小時；每次zui多只能處理6個樣品；需要大量的起始材料；產量不高。需一臺超速離心機。

磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面*的表面標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

外泌體分離：

通過簡單離心，從體液、血液、尿液、細胞中分離外泌體（Exosome），相比超速離心，安全、快速，經過兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白，從而獲得高純度和高產量的外泌體。

外泌體RNA/蛋白的分析

目前，通常使用組織診斷法進行癌癥檢測，如熒光原位雜交（FISH）和免疫組織化學（IHC）。但是這樣基于組織診斷的方法具有很大的局限性，因為需要較大量的組織樣本，其不能對癌癥變化進行實時監控，不能準確地反映當前的疾病狀態。而外泌體診斷測試通過從尿液、血液和體液中提取的外泌體獲得遺傳信。Exosomes是由所有含RNA、DNA和蛋白的活細胞釋放的信使。因為Exosome包含來源于母細胞的信息，因此在腫瘤學上，基于外泌體的體液活檢對整個腫瘤活動提供了一個實時監控并可對疾病的重要變化進行檢測。

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